睿智医药：KIF18A选择性抑制剂——开启靶向染色体不稳定性（CIN）的抗癌药物研发新时代

在细胞分裂过程，遗传物质分离的精准性对生物体而言极为重要，而因染色体分离异常导致的遗传物质分配不均的状态则被称为染色体不稳定性（Chromosomal Instability, CIN）。作为大部分人类癌症共有的标志，CIN不仅在超过90%的实体瘤和血液瘤中都有发生，而且其高水平还与弥漫性大B细胞淋巴瘤、肺癌、乳腺癌等癌症的不良预后相关。之外，CIN通过增加肿瘤异质性，为肿瘤进化提供途径，在促进癌症的转移、扩散进程以及耐药性的产生方面也发挥作用。^[2,3,4]因此，针对CIN的癌症治疗策略的开发有望为癌症治疗拓宽道路，寻找更具优势的临床治疗方案。

由于CIN 是持续有丝分裂错误的产物，所以靶向有丝分裂机制不失为一种对抗CIN的好选择。虽然此前科学家们已经针对有丝分裂机制开发了一些靶向药物，如Aurora激酶、PLK1和TTK/Mps1的抑制剂，但受到常见于如骨髓、肠道等增殖部位的剂量限制性毒性影响，使这些抗有丝分裂药物的临床应用和“针对CIN癌症治疗策略”的发展都受到了限制。而这种毒性限制本质上是早期有丝分裂抑制剂无法有效“区分”正常细胞与癌细胞的结果。因此，开发出对癌细胞靶向性好、且同时不影响正常细胞增殖的低毒、高选择性抗癌药物或将为“针对CIN癌症治疗策略”的发展找到方向。

KIF18A作为一种ATP依赖的微管马达蛋白，在有丝分裂中通过抑制微管动态不稳定性，促进染色体向中期板的正确排列；通过稳定动粒-微管附着，维持染色体双极拉力的平衡，从而确保纺锤体检查点（SAC）通路适时关闭，最终推动细胞从中期向后期过度。虽然当细胞缺乏KIF18A时会现出染色体振荡增加和染色体排列减少，导致细胞具有更宽的中期板，但有趣的是，正常细胞对KIF18A的缺失具有耐受性，即使缺失仍能完成有丝分裂；而某些癌症细胞的增殖过程中，KIF18A的缺失会则导致有丝分裂缺陷并使癌细胞最终死亡。

正是癌细胞与正常细胞在有丝分裂过程中对KIF18A需求的差异启发了科学家们——在成功筛选并验证出 KIF18A 作为 CIN 肿瘤治疗靶点的潜力后，开发出了靶向CIN 肿瘤的 KIF18A高选择性小分子抑制剂 VLS-1272。而该分子的发现不仅说明了KIF18A抑制是一种有前景的癌症治疗方案，也为靶向CIN 肿瘤治疗策略的研究提供了新的突破口。

该文章首先利用Cancer Dependency Map（DEPMAP）数据库，通过从CIN相关性分级、必须基因的显著性分析和KIF18A在癌细胞增殖方面的必须性三个层面，对CINHigh癌细胞的KIF18A敏感性进行了递进式分析，确认了KIF18A作为新型癌症治疗靶点的潜力。

图1 筛选潜在的CIN癌症治疗靶点

随后，该研究通过系统性实验验证了 KIF18A 的依赖性，从体外、体内两个层面，证实了CIN细胞是通过依赖KIF18A蛋白来实现增殖的事实，且KIF18A可作为CIN癌症潜在治疗靶点值得被继续研究。

首先是体外层面的验证，在成功构建CIN^High/ CIN^Low细胞模型的基础上，该研究首先使用CRISPR-Cas9基因编辑技术，分别敲除CINHigh/ CIN^Low细胞中的KIF18A基因，并通过细胞增殖实验确认了KIF18A蛋白对CIN^High/ CIN^Low细胞增殖的不同影响。接着，通过检测siRNA沉默KIF18A基因后不同CIN水平的乳腺癌细胞细胞存活率，验证了KIF18A蛋白缺失对癌细胞抑制的普遍性，且观察到抑制程度与细胞CIN水平的正相关性。此外，shRNA敲低KIF18A细胞的生长抑制实验结果则再次证实了增殖对KIF18A蛋白的依赖性，而其细胞周期分析结果则表明这种依赖可能是细胞在G2/M期停滞的结果。

图2 KIF18A作为CIN癌症潜在治疗靶点的验证

在动物实验中，该研究则评估了肿瘤生长对KIF18A蛋白的依赖。与对照组相比，携带表达诱导型KIF18A shRNA肿瘤的小鼠经多西环素（Dox）处理后肿瘤生长延迟，且肿瘤样本的Western blot分析结果则证实了生长受限瘤体中癌细胞的KIF18A蛋白的低表达。

在确认了CIN相关癌细胞增殖对KIF18A蛋白的依赖性后，考虑到KIF18A蛋白延微管易位的动力来源于其马达区ATPase水解ATP所释放的能量。Volastra Therapeutics研究团队着眼于通过开发KIF18A ATP 酶活性抑制剂来实现靶向KIF18A的CIN相关癌症治疗。

为了获得靶向KIF18A的优秀小分子抑制剂，该研究首先对5万个化合物的ATP酶活抑制能力进行了高通量筛选。在得到了优势化合物VLS-1272后，即对该化合物在体外、体内效能、药代动力学特性以及作用机制展开了详细的研究。

体外生化实验利用ADP-Glo assay format，不仅验证了VLS-1272对ATPase的抑制能力；通过ATP依赖性分析证实了VLS-1272对ATP的非竞争性抑制机制；利用GPCA（Global Progress-Curve Analysis）进行动力学分析，获得了VLS-1272的k_on（0.037 ± 0.010 nM⁻¹h⁻¹）、k_off（≤0.02 h−1）和K_I（≤0.5 nM）等重要参数，发现了 VLS-1272 的缓慢结合和缓慢k_off的动力学特征；还通过对比VLS-1272 对多种驱动蛋白的抑制能力，确定了该化合物对KIF18A的高选择性。

表1 VLS-1272 对人类和小鼠驱动蛋白的选择性总结

图3 VLS-1272 对KIF18A抑制效能评价和机制研究

该研究在前期验证CIN癌细胞增殖对KIF18A的依赖性时，发现KIF18A基因敲除会导致MDA-MB-231细胞增殖受抑制。而VLS-1272处理CIN^High和CIN^Low细胞后造成的增殖抑制的差异则进一步证明了CIN^High细胞对KIF18A功能的依赖。此外，VLS-1272对CIN^High肿瘤细胞表现出的强增殖抑制能力，对比其在CIN^Low细胞系CAL51中的有限抑制能力，则在细胞水平证明了VLS-1272作为KIF18A抑制剂对CIN癌症治疗的可能性和对CIN癌细胞的偏好；此外，本研究在100余种癌细胞系中对的VLS-1272的分析则显示，VLS-1272对染色体不稳定肿瘤的特异性显著区别于早期抗有丝分裂药物。而对比早期抗有丝分裂药物的剂量限制性毒性，随着用药剂量增加，VLS-1272对几种正常细胞增殖的无影响则说明KIF18A的抑制在对染色体不稳定的肿瘤细胞具有选择性的同时也更具有安全性。该研究还特意评估了不同用药剂量下VLS-1272对离体健康T细胞的增殖抑制实验，结果显示该抑制剂对T细胞的增殖也无影响。不仅如此，48小时内VLS-1272的抗增殖效应，在 CIN^High细胞系（JIMT-1）中还表现出明显的剂量依赖性增加，而在CIN^Low细胞系（CAL51）中则没有。

图4 VLS-1272的细胞实验

纺锤体组装检查点（SAC）的适时沉默对于细胞从中期向后期的过度十分重要。已知KIF18A缺失可以导致SAC的激活，而完整的SAC又是KIF18A缺失诱导的有丝分裂停滞所必需的。所以评估VLS-1272在SAC抑制条件下对 CIN癌细胞增殖的抑制十分有必要。该文章利用细胞水平的药物协同实验，用低剂量MPS1抑制剂BAY-1217389，通过抑制MPS1在保持细胞活性的同时减弱SAC，随后检测细胞生长情况。检测结果显示，BAY-1217389诱导SAC减弱后VLS-1272抗增殖能力也随之下降。这一结果不仅证实了SAC的激活是KIF18A抑制导致增殖缺陷的关键因素，也更为有力的证实了VLS-1272是通过抑制KIF18A达到CIN癌细胞增殖抑制的。

该研究还通过对KIF18A高敏感的HCC15和OVCAR-3肿瘤模型开展了动物实验，证实了VLS-1272强大的剂量依赖性肿瘤生长抑制作用，和口服生物利用度高、用药后各项指标维持良好等优秀的药代动力学特性。

细胞洗脱实验进一步支持了VLS-1272的缓慢解离特征；而VLS-1272和已报到工具化合物在KIF18A上的对接分析提示VLS-1272的别构抑制机制。另一层面，微管依赖实验表明VLS-1272活性具有微管依赖性，这与VLS-1272结合KIF18A-微管复合物有关；体外的微管滑动实验、有丝分裂细胞中KIF18A的定位研究以及pHH3阳性染色对有丝分裂细胞数量的分析实验则证明了VLS-1272的体外作用机制是通过抑制 KIF18A 的 ATP 酶活性，影响其易位能力，使被抑制的KIF18A固定于靠近纺锤体极的微管上，且不再沿着中期板排列，进而阻碍细胞从有丝分裂中期向后期发展；而通对动物模型提供的肿瘤切片进行共定位分析、有丝分裂细胞数目量化，则进一步证实了VLS-1272在体内抗肿瘤能力与作用机制。

基于CIN在众多癌细胞中普遍存在的特点和KIF18A缺失对癌细胞和正常细胞增殖影响的差异性，本研究提出了一种通过抑制KIF18A靶向CIN肿瘤的新型治疗策略。通过高通量筛选得到的VLS-1272是一种高选择性KIF18A抑制剂——不仅在体内外模型中展现出显著的抗肿瘤效果，还对CIN^High癌细胞表现出高选择性。机制研究揭示，VLS-1272通过干扰KIF18A的ATP酶活性，导致有丝分裂期KIF18A从微管正末端重新定位，进而减少染色体排列并导致有丝分裂阻滞；并且，持续的染色体不稳定性以及活跃的有丝分裂检查点（SAC）的存在，共同促成了VLS-1272的抗增殖效应。

除显著的抗肿瘤效果和对CIN^High癌细胞表现出高选择性外，VLS-1272对有丝分裂的正常细胞及免疫细胞（T细胞）也更为 “友好”。明显区别于其他抗有丝分裂药物，随着药物剂量的增加，VLS-1272对正常细胞及免疫细胞（T细胞）并没有生长抑制作用；且与可能导致中性粒细胞减少症等不良反应的抗有丝分裂药物不同，体内的造血谱系在很大程度上不受KIF18A抑制的影响，这些都提示KIF18A抑制剂更具安全性。而这种安全性或将有利于未来的免疫疗法联用，以增强治疗效果并克服耐药性。

这些结果不仅提示了KIF18A抑制剂可能具有的广泛的临床应用前景，还为靶向CIN肿瘤的治疗提供了新的思路，并为未来临床试验的开展奠定了基础。

CIN在多种癌症中普遍存在，包括肺癌、卵巢癌和胃癌，这表明KIF18A抑制剂可能具有广泛的临床应用前景。这篇文章只展示了临床前的研究成果，对于KIF18A抑制剂的临床效果还需进一步的验证。相较于早期抗有丝分裂药物在骨髓等方面的毒性，KIF18A抑制在靶向CIN癌症的治疗中对增殖的正常细胞及免疫细胞表现出的安全性，或将为靶向CIN癌症的治疗策略的发展提供更多的空间，如与其他治疗药物、治疗策略的联用。而对抗CIN可能也会为癌症治疗提供解决癌细胞转移扩散、耐药等问题的新思路。

本文最后还致谢了睿智医药体外药理、药效团队和细胞团队的贡献。作为Volastra Therapeutics的合作伙伴，我们的工作能够赢得其一定的认可，倍感欣慰。

最后，谨以该研究参与者睿智医药 生物药理部资深总监许煜洲的话，致敬过往，展望未来——过往如基石，为今朝一切筑牢根基。而今，我们需以更深邃的洞察、更好的平台，潜心钻研，为明日更好的药物开发。

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