睿智医药：四氯化碳（CCl₄）诱导肝纤维化模型
肝病已成为亚太地区的主要死亡原因之一，全世界有超过8亿人患有慢性肝病。大多数慢性肝病最终会发展成肝纤维化，肝脏纤维化发生在肝脏受伤或发炎后，肝脏细胞会刺激伤口愈合，在伤口愈合过程中，肝脏中会积聚过多的蛋白质，如胶原蛋白和糖蛋白。最终，经过多次修复后，肝细胞（称为肝实质细胞）无法再自我修复，多余的蛋白质形成疤痕组织或纤维化。
纤维化本身不会引起任何症状，但严重的瘢痕可能导致肝硬化，从而引起症状。在发展为肝硬化的患者中，40%是无症状的， 一旦出现并发症，可能包括腹水、食管静脉曲张或黄疸[1]。
肝纤维化的病因主要与病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝和自身免疫性疾病等有关[2]，通常根据数量分为五个阶段：F0—无纤维化；F1—轻度纤维化，细胞周围胶原沉积；F2—中度纤维化，开始出现桥接纤维化；F3—重度纤维化，定义为存在广泛隔膜形成；F4—肝硬化。
肝纤维化是肝细胞的伤口愈合反应的结果（图1）。如果不加以预防，可能会导致肝癌和肝功能衰竭。
图1. 肝纤维化形成原因[3]
肝纤维化是慢性肝病进展的关键阶段，其治疗靶点和药物的研发一直是临床研究的热点，目前临床上肝纤维化的主要治疗策略是：
1)调节TGF-β信号通路：TGF-β（转化生长因子-β）是肝纤维化发生的核心驱动因子，其通过激活下游信号通路促进肝星状细胞（HSC）的活化和增殖，从而导致细胞外基质（ECM）过度沉积。
2)调控肝星状细胞（HSC）：抑制HSC的激活和增殖，减少其向肌成纤维细胞转化[4]
3)抑制炎症反应：抑制炎症因子的产生和作用，减少肝细胞损伤和纤维化
4)改善脂质代谢调控：改善肝脏代谢功能，减少脂肪沉积和脂毒性
目前临床上肝纤维化主要和潜在治疗药物有：
1)抗纤维化药物：秋水仙碱
2)代谢调节药物：司美格鲁肽等GLP-1R激动剂
3)抗氧化剂：水飞蓟素
4)抗病毒药物：干扰素α、恩替卡韦和替诺福韦等（可用于治疗慢性病毒乙肝、丙肝等感染导致的纤维化）
5)中药及复方制剂：安络化纤丸、扶正化瘀胶囊、鳖甲软肝片。
睿智医药生物药理药效部门在肝纤维化模型临床前药效学研究方面积累了丰富经验，已成功建立四氯化碳（CCl₄）诱导的C57BL/6小鼠肝纤维化模型，可助力合作伙伴开展肝脏疾病相关新药研发的临床前药效学研究。
CCl₄诱导的肝纤维化模型
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模型简介
四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠肝纤维化是被广泛接受的研究肝纤维化实验模型。它在许多方面反映了与毒性损伤相关的人类疾病模式，如α-SMA表达、星状细胞活化和关键基质成分（包括胶原蛋白-1、基质金属蛋白酶及其抑制剂TIMPs）已在该模型的发病机制中得到证实。
CCl₄的毒性分为三到四个不同的阶段。最初两三周以肝脏坏死为主要表现，表现为肝脏特异性酶活性升高，假性胆碱酯酶值下降。随后两三周，肝脏出现大量脂肪沉积，血清甘油三酯和天冬氨酸氨基转移酶（AST）显著升高，肝功能减退。第三阶段，AST继续升高，羟脯氨酸和甘油三酯升高，整体肝功能进一步下降。最后阶段，假性胆碱酯酶值进一步下降，肝脏出现萎缩。这可能与血清白蛋白显著下降和体重减轻有关，这表明在长期纤维化过程中肝功能逐渐丧失。CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型因其可重复性和病理相关性，广泛用于保肝药物（如抗炎、抗氧化、抗纤维化化合物）的初筛。
7周龄的雄性SPF级别C57BL/6小鼠，在IVC独立通风系统的动物设施里适应性饲养约一周后，每周两次腹腔注射CCl₄诱导，8周后结束实验。
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模型数据
图2. 实验流程
图3. 小鼠的体重和肝重/体重
图4. 血生化指标检测
图5. 四氯化碳（CCl₄）诱导2周后评分及病理图片
图6. 四氯化碳（CCl₄）诱导4周后评分及病理图片
图7. 四氯化碳（CCl₄）诱导8周后评分及病理图片
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模型总结
睿智医药开发验证的四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠肝纤维化模型中，从第2周开始：
肝重/体重比增加
ALT和AST血清浓度升高。
组织病理学特征：肝脏明显坏死，细胞质明显减少，肝脏有明显的炎症细胞浸润，出现肝纤维化，剖检时肝脏颜色较浅，体积较大，有可见的结节。
四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠肝纤维化模型优势：
模型稳定性和可重复性高：
研究显示，通过每周2次注射CCl₄溶液（浓度10%-20%），持续4-8周，可显著诱导小鼠血清ALT、AST升高及胶原沉积，病理学特征与人类肝纤维化相似。
病理特征明确且便于检测：
CCl₄诱导的肝纤维化模型在组织学上表现为肝细胞坏死、炎症细胞浸润、胶原纤维增生及假小叶形成，这些变化可通过HE染色、Masson染色和天狼星红染色清晰观察到。
适用于多种分子机制研究：
CCl₄模型不仅可模拟肝纤维化的形态学变化，还可用于探究炎症反应、氧化应激、信号通路调控等多维度机制。
时间周期灵活，适应不同研究需求：
短期模型（4周）：适用于急性肝损伤和早期纤维化研究。
长期模型（8-12周）：可模拟慢性肝纤维化甚至肝硬化阶段，适合评估药物长期干预效果。
CCl₄诱导的肝纤维化药效验证
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模型简介
Resmetirom (Rezdiffra™) 是一种口服甲状腺激素β受体 (THR-β) 激动剂[5]，由 Madrigal Pharmaceuticals, Inc. 开发，通过特异性靶向THR-β发挥作用，THR-β在肝脏中高表达，参与调节肝脏脂质代谢和炎症，调节脂质代谢基因，增加肝脏脂肪代谢，减少脂肪毒性，从而减少肝脏脂肪堆积和炎症[5,6]，与饮食和运动相结合，用于治疗伴有中度至晚期肝纤维化（符合 F2 至 F3 期纤维化）的非肝硬化性 NASH 成人患者。
7周龄的雄性SPF级别C57BL/6小鼠，在IVC独立通风系统的动物设施里适应性饲养约一周后，每周两次腹腔注射CCl₄诱导，同时给予Resmetirom治疗，6周后结束实验。
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模型数据
图8. 实验流程
图9. 给药后小鼠体重和肝重/体重
图10. 给药后血生化指标检测
图11. 给药后评分及病理图片
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模型总结
睿智医药开发验证的四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠肝纤维化模型中，经Resmetirom治疗后：
肝重/体重比降低
ALT和AST血清浓度显著降低。
组织病理学特征：
四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠纤维化、炎症、气球样变性评分显著升高
经Resmetirom治疗后，气球样变性评分显著降低。
肝纤维化是一个重要的全球性健康问题，因此需要开发和验证可用于此疾病领域的临床前小鼠模型。睿智医药的四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠肝纤维化模型，为合作伙伴评估针对肝病的治疗提供了一个强大的平台。
参考文献：
1. Tsukada S, Parsons C J, Rippe R A. Mechanisms of liver fibrosis[J]. Clinica chimica acta, 2006, 364(1-2): 33-60.
2. Zhang, L., Liu, C., Yin, L. et al. Mangiferin relieves CCl₄-induced liver fibrosis in mice. Sci Rep 13, 4172 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30582-3.
3.Bataller R, Brenner D A. Liver fibrosis[J]. The Journal of clinical investigation, 2005, 115(2): 209-218.
4.Zhang CY, Liu S, Yang M. Treatment of liver fibrosis: Past, current, and future. World J Hepatol. 2023 Jun 27;15(6):755-774. doi: 10.4254/wjh.v15.i6.755. PMID: 37397931; PMCID: PMC10308286.
5. Suvarna, R., Shetty, S. & Pappachan, J.M. Efficacy and safety of Resmetirom, a selective thyroid hormone receptor-β agonist, in the treatment of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD): a systematic review and meta-analysis. Sci Rep 14, 19790 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-70242-8.
6. Kokkorakis, M. et al. Resmetirom, the first approved drug for the management of metabolic dysfunction-associated steatohepatitis: Trials, opportunities, and challenges. Metab. Clin. Exp. https://doi.org/10.1016/j.metabol.2024.155835 (2024).
